抗原準備－偶聯方法
來源：admin 瀏覽量： 發布時間：2018-01-10 16:56:49
化學合成的多肽抗原是小分子，本身很難具有好的抗原性，只能誘導動物產生很弱的免疫反應，因而與載體蛋白耦聯是很重要的。載體蛋白含有很多抗原決定基，能夠刺激T－幫助細胞，進而誘導B－細胞反應。用于與多肽耦聯的載體蛋白有多種，其中最常用的是keyhole limpet hemacyanin (KLH), 牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）, 卵清蛋白（ovalbumin，OVA）和牛甲狀腺球蛋白（bovine thyroglobulin，THY)。KLH具有更高的抗原性，是最為常用的多肽耦聯載體。BSA也常用來作為多肽載體，但由于BSA經常被用做檢測試驗的阻斷劑而使得該方法生產的抗體在應用上存在著一定的局限性。
設計合成性多肽常常被忽略的一個方面是如何將多肽耦聯到載體蛋白上。例如，N－端序列需要通過C－端氨基酸耦聯，而C－端序列則需要通過N－端氨基酸耦聯。內部序列則可以耦聯到任何一端。內部序列耦聯的另一考量則是將非共軛端酰基化或氨基化，因為原蛋白分子序列中不會含有帶電荷的末端。最常用的耦聯方法都是基于自由氨基(alph-氨基 或 Lys)、sufhydryl (Cys)或羧基集團(Asp, Glu, 或 alpha-羧基)的存在。所有的耦聯方法都應該是通過羧基或氨基端殘基將多肽耦聯到載體蛋白上。所選序列不能有多個殘基都能參與所選耦聯化學反應。如果多個反應位點存在，可以考慮將多肽序列縮短，或者選擇所有反應位點都位于一端的多肽。對于內部序列通常會使用離所預測抗原位點較遠的一端進行耦聯，這樣可以避免可能的屏蔽問題。
除非研究人員另做說明，我們通常使用EDC (1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride)或carbodiimide 方法將多肽和載體進行耦聯。Carbodiimides能激活天冬酰胺酸及谷氨酸的側鏈羧基集團及末端羧基集團，使之與主胺基發生耦聯反應。激活的多肽與載體蛋白混合而產生最終的共軛體。如果載體蛋白先被激活，EDC方法則通過N－末端alpha－氨基，或者，如果序列中有賴氨酸的話，則可以通過賴氨酸的側鏈氨基與載體蛋白耦聯。m-Maleimidobenzoyl-N-hydroxysuccinimide 酯(MBS)是一種雙性多肽耦聯試劑，可以將多肽與載體蛋白通過半胱氨酸耦聯。耦聯發生在半胱氨酸的硫醇基。如果多肽序列中不包括半胱氨酸，可以將一個半胱氨酸加到多肽的N-端或C-端，以獲得可控性更強的多肽與載體蛋白的耦聯。為了合成方便，我們建議將半胱氨酸加到多肽的N-末端。戊二醛是一種雙作用耦聯試劑，可以將兩個化合物通過氨基集團耦聯在一起。戊二醛能起到非常靈活的間隔多肽和載體蛋白的作用，時多肽能盡可能的暴露給免疫系統。但是，戊二醛是一種反應性很強的化合物，可以和Cys, Tyr及His等氨基酸發生一定程度的反應。反應后會形成結構很難預測的共軛體。因此，如果多肽序列末端只含有一個單一的自由氨基時，戊二醛方法非常有用。如果多肽含有多個自由氨基集團，會形成多聚合物，結構很難預測，盡管有很高的抗原性。
因為與BSA耦聯的多肽刺激產生的抗血清也含有針對BSA的抗體，一次可能導致假陽性結果。盡管KLH較大并有抗原行，但它在耦聯過程中可能會沉淀，因而有時候會很難處理。卵清蛋白（OVA）是另一種可以使用的載體蛋白。當要檢驗抗體只是針對多肽而不是針對載體蛋白時，OVA時用作第二載體的很好選擇。當要將抗體抗載體蛋白的反應降到最低時，可以使用兔血清白蛋白做載體。用RSA耦聯體免疫過的兔子不太可能產生針對載體的抗體，因為RSA是兔子自身的蛋白。如果注射動物不是兔子RSA則不會被認為是自體蛋白。
免疫系統是對多肽－載體蛋白整體發生反應的，即免疫反應有一部分是針對耦聯多肽，一部分是針對中間連接體，有一部分是針對載體蛋白。當用ELISA做篩選時建議使用不同載體蛋白耦聯的多肽聚合物。如果ELISA是在非耦聯多肽涂層的多孔板上做時則沒有必要這樣做。
